PORPHOBILINOGEN AUS (5-AMINOLÄVULINSÄURE
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logischer NaCl-Lösung und anschließend mit Tris/HCl-
Puffer (pH 8,2; 0,05-m. an Tris) gewaschen.
100 g Bakterienfeuchtmasse werden in 915 ml Tris/
HCl-Puffer gleicher Zusammensetzung suspendiert.
Diese Suspension wird unter Rühren und Durchleiten
von N2 auf 70 °C erwärmt, mit einer Lösung von
600 mg (5-Aminolävulinsäure-hydrochlorid (dargestellt
Verwendung von Bakterienfeuchtmasse am günstig-
sten. Mit diesen Zellen sind drei aufeinander fol-
gende Inkubationen mit praktisch gleicher Porpho-
bilinogen-Ausbeute möglich.
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t 18 ) in 70 ml H20 , deren
pH mit Tris-Lösung auf 8,2 eingestellt wurde, versetzt
und unter weiterem Rühren und Durchleiten von N2
30 Min. bei 70 °C inkubiert.
Fermentation von P. shermanii15. Die Gärungen mit
P. shermanii wurden in 10-/-Steilbrustflaschen mit je
11 Medium bei 28 —30 °C durchgeführt. Das Nähr-
medium setzte sich wie folgt zusammen [g] : 385 Corn-
steep-Trockenpulver, 17,5 Bacto-Yeast Extract, 12,3
NaH2P 0 4 , 12,3 K3P 0 4 , 2,8 MgCl2-6H 20 , 0,07
F eS 0 4 , 7 / HoO. Die angeführten Bestandteile wurden
in der angegebenen Menge H20 gelöst bzw. suspen-
diert. Dann wurde das pH auf 6,9 eingestellt (mit
KOH), und ca. 45Min. bei 120 LC im Autoklaven er-
hitzt. Nach dem Erkalten filtrierte man vom Ungelösten
ab und stellte den pH-Wert, der beim Erhitzen absank,
erneut auf 6,9 ein. Anschließend wurde das Gärmedium
bei 120 °C im Autoklaven während 60 Min. sterilisiert.
Zur Beimpfung dienten 700 ml Impfkultur, deren Me-
dium sich wie oben beschrieben zusammensetzte. Durch
tägliche Zugabe von 140 ml steriler 50-proz. Glucose-
Lösung (der Glucose-Gehalt soll ungefähr \% betra-
gen) und Einstellen des pH mittels steriler, gesättigter
Soda-Lösung auf 6,8 wurde die Gärung während der
jeweils angegebenen Gärdauer in Gang gehalten. Dann
wurden die Bakterien abzentrifugiert und mit physio-
logischer NaCl-Lösung gewaschen.
Man kühlt das Inkubationsgemisch ab, entfernt die
Zellmasse durch Zentrifugieren und stellt das pH der
Lösung mit verdünnter HCl auf 7,2 ein. Anschließend
wird die Lösung auf eine Säule (20 cm Länge, 4,5 cm
Durchmesser) aus DEAE-Cenllulose (DEAE-Sephadex
A-25) gegeben, deren Chlorid-Form mit Tris/HCl-Puf-
fer (pH 7,2; 0,05-m. an Tris) so lange gewaschen wor-
den war, bis der Durchlauf ein pH von 7,2 hatte. Man
eluiert mit diesem Puffer bis kein Porphobilinogen
mehr von der Säule kommt, stellt das pH des Eluats
mit verdünnter HCl auf 4 ein und fällt mit 20-proz.
Quecksilber (II) -acetat-Lösung. Der Niederschlag wird
abzentrifugiert, mit 1-proz. Quecksilber (II)-acetat-
Lösung gewaschen und in wenig H20 suspendiert.
Dann zersetzt man mit H2S, zentrifugiert vom HgS ab
und extrahiert dieses zweimal mit wenig H20 . Die ver-
einigten Uberstände werden im Vakuum schonend auf
ca. 5 ml eingeengt. Anschließend stellt man die Lösung
mit verdünntem Ammoniak auf pH 4 ein. Dabei schei-
det sich Porphobilinogen als Rohprodukt ab 19.
Nach 12 Stdn. im Kühlschrank wird der Nieder-
schlag abzentrifugiert. Im Zentrifugenbecher fügt man
zur Auflösung des Porphobilinogens wenig 0,5-n. Am-
moniak hinzu und zentrifugiert vom Ungelösten ab.
Dieses wird nochmals mit wenig 0,5-n. Ammoniak ex-
trahiert. Das pH der vereinigten ammoniakalischen Lö-
sungen stellt man zur Fällung des Porphobilinogens
mit Eisessig vorsichtig auf 4 ein und läßt über Nacht
im Kühlschrank stehen. Die Kristalle werden abge-
Inkubation von d-Aminolävulinsäure mit Zellsuspen-
sionen von P. shermanii. Die Inkubationsansätze (s.
Abb. 1 —8 bzw. Tab 2 —5) zur Ermittlung der optima-
len Versuchsbedingungen bestanden meist aus 2,8 ml
Zellsuspension und 0,2 ml (5-Aminolävulinsäure-Lösung.
Nach Ablauf der gewählten Inkubationszeit wurde die
Reaktion durch Zugabe von 1 ml einer Trichloressig-
säure und HgCl2 enthaltenden Lösung (80 ml 10-proz.
Trichloressigsäure und 20 ml 0,2 m HgCl2) abgebro-
chen. Nach Abzentrifugieren der Zellmasse wurde Por-
phobilinogen spektrophotometrisch nach Mauzerall und
Granick 16 durch Messung der Extinktion bei 555 mju
bestimmt, wobei E h r l i c h s Reagenz (2 g p-Dimethyl-
aminobenzaldehyd in 100 ml 6-n. HCl) mit 5 g HgCl2
je 100 ml Lösung versetzt wurde. (5-Aminolävulinsäure
saugt, mit eiskalter verdünnter Essigsäure (pH
= 4)
und gleich anschließend mit wenig kaltem Aceton ge-
waschen. Man trocknet im Exsiccator über KOH. Aus-
beute: 92 mg Porphobilinogen (21%).
Herrn Professor Dr. H.
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e d e r e c k , der Deutschen
wurde mit Hilfe der Pikratmethode nach E llio tt 17 Forschungsgemeinschaft und dem Verband der Chemi-
schen Industrie danken wir für die Förderung unserer
durch Messung der Extinktion bei 495 mju bestimmt.
Gewinnung von Porphobilinogen. Man läßt einen
Gäransatz von P. shermanii unter oben beschriebenen
Bedingungen 3 Tage wachsen. Die durch Zentrifugie-
Arbeiten. Ferner sind wir Frau
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e r , Frau
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und Fräulein
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fleißige und gewissenhafte Mitarbeit zu Dank verpflich-
ren gewonnene Bakterienfeuchtmasse wird mit physio- tet.
18 A.
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e u b e r G e r
and J. J.
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c o t t , J. chem. Soc. [London]
13 K. b e r n h a u e r , E. b e c h e r u . G. W i l h a r M , A r c h . B i o c h e m i s t r y
1954, 1820.
8 3 ,2 4 8 [1959],
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a u z e r a l l an d S. G r a n i c k , J. b i o l . C h e m i s t r y 219, 435
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